Le réactif L-alanine-4-nitroanilide est hydrolysé par l'enzyme amino-peptidase contenue dans la cellule bactérienne des micro-organismes Gram négatifs 1,2.
Le bâtonnet imprégné du réactif L-alanine-4-nitroanilide est placé en contact direct avec la colonie bactérienne à examiner et, par la suite, sous l'action de l'agent de détection (réactif du test de Gram), il développera une couleur bleue-violette intense dans le cas des micro-organismes Gram négatifs.
Les colonies de micro-organismes Gram-positifs ne développent aucune couleur.