L'enzyme β-galactosidase, qui permet aux bactéries de métaboliser le lactose en le divisant en glucose et en galactose, hydrolyse le substrat incolore ONPG (ortho-nitrophényl-β-D-galactopyranoside) avec la formation d'o-nitrophénol, un composé jaune.
Les bactéries qui produisent l'enzyme tryptophanase sont capables de dégrader l'acide aminé tryptophane en acide pyruvique, ammonium et indole.
L'indole produit réagit avec le p-diméthylaminobenzaldéhyde du réactif de Kovac (indole) pour former un composé rouge-violet. L'enzyme βglucuronidase clive le substrat incolore MUG (4-méthylumbelliféryl-β-D-glucuronide) pour produire de la 4-méthylumbelliférone, qui devient fluorescent sous l'effet de la lumière ultraviolette à ondes longues (environ 366 nm).